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本试剂盒是基于TdT末端转移酶能够在RNA的3'端添加NTP尾巴的原理上开发的，标记的探针可用于电泳迁移率实验(EMSA)、原位杂交(ISH)、Northern Blot(不推荐用于低丰度RNA检测)、小RNA Northern、Southern Blot(不推荐用于单拷贝基因检测)、菌落杂交、斑点印迹杂交分析等。

• 在0.2mL微量离心管中按下表设置一个20μL体系的标记反应(如果需要标记更多探针，请增加标记体积而不要增加探针RNA的浓度)：
  

  成分	用量
  自备RNA模板	100～200pmol
  5×TdT Buffer	4μL
  DIG-11-UTP	1μL
  2mM ATP	1μL或不加
  TdT末端转移酶(10U/μL)	2μL
  超纯水	至20μL

  • ATP可以不加，这样得到的加尾全部是标记核苷酸，但由于DIG或biotin的空间阻碍，这种探针的灵敏度并不是最佳。如果在加尾反应时掺入一定比例的ATP，控制标记核苷酸的密度不至于太高，这样反而可以提高探针的比活。标记核苷酸和非标记的ATP的具体比例为多少，可以自己优化。一般可以选择1∶2。
• 37℃反应30分钟。如果没有非标记核苷酸存在，一般只能加尾3～5个标记的核苷酸(因为标记基团通过空间阻碍抑制延长反应)；如果在加尾反应中加入一定比例的非标记核苷酸ATP(其他NTP也可，只是本试剂盒只提供ATP而已)，每条探针上可加上约100个核苷酸，平均含5个标记核苷酸。
  
• 70℃ 10分钟灭活TdT酶。
  
• 如果需要，可以PAGE电泳+银染检测标记效率，带标记的RNA探针的泳动速度将低于没标记的RNA分子。
  
• 如果是非同位素标记，探针不需纯化可以直接用于杂交。如果需要纯化非同位素标记的探针，请不要酚/氯仿抽提，因为非同位素标记物一般会使探针RNA进入有机相而丢失。
  
• 使用时需将探针以1～8ng/μL的终浓度加入到杂交液中。如果不立即使用，非同位素标记的探针RNA可-20℃长期放置一年，同位素标记的探针RNA不能放置。